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照射効果（ＩＲＲＡＤＩＡＴＩＯＮ　ＥＦＦＥＣＴ）：食品に放射線を照射した場合の貯蔵、衛生化等の効果

病原菌の殺菌（肉・肉製品・家禽肉）

発表場所 : 食品照射、ｖｏｌ．２７（１，２）、１９−２６．
著者名 : 野々宮　孝、伊藤　均＊、森本　明徳、山城　富男＊＊、石垣　功＊、岩槻　和男、堤　孝正
著者所属機関名 : 農林水産省動物検疫所（〒２３５　神奈川県横浜市磯子区原町１１−１）、＊日本原子力研究所・高崎研究所（〒３７０−１２　群馬県高崎市綿貫町１２３３）、＊＊科学飼料研究所ワクチンセンター（〒２８５　千葉県佐倉市大蛇町７）
発行年月日 : １９９２年

γ線照射によるＲＮＡウイルスの不活化

γ線照射によるＲＮＡウイルスの不活化

○ 序

　現在輸入されている畜産物の種類は多岐にわたっており、これらの畜産物について動物検疫上特に問題になる家畜ウイルス性疾病として、口蹄疫、牛疫、アフリカ豚コレラをはじめとする海外悪性伝染病があり、その侵入防止には万全を期している。輸入畜産物の一部は到着後、輸出国及び種類に応じて薬品による消毒を実施しているが、畜産製品の変質を考えると対象物及び消毒方法に限界がある。近年、γ線が食品照射、実験動物用飼料及び医療用具の滅菌等に活用されていることから、今回ＲＮＡウイルスを用いて、γ線によるウイルスの不活化効果及び血清タンパク質への影響について検討を行った。

○ 材料および方法

１ 供試ウイルス

　水胞性口炎（ＶＳ）、牛ウイルス性下痢・粘膜病（ＢＶＤ・ＭＤ）、牛ＲＳ（ＲＳ）及びブルータング（ＢＴ）の４種のウイルスを用いて、ドライアイス凍結下及び室温下でγ線によるウイルスの不活化試験を実施した（表−１）。

　γ線照射前の各ウイルス力価は、室温下では１０・Ｅ（５．６）〜１０・Ｅ（７．８）、ドライアイス凍結下では、１０・Ｅ（５．３）〜１０・Ｅ（７．５）（ＴＣＩＤ５０：５０％感染終末点／ｍｌ）であった。

２ γ線照射

　γ線照射は日本原子力研究所高崎研究所で実施し、室温照射では、照射当日ウイルス液を調製し、室温約１５℃で照射した。ドライアイス凍結照射では、ウイルス浮遊液を調製し−８０℃で凍結保存した。照射当日は、凍結したままドライアイスに入れ輸送した。また、照射中もドライアイス下に置いた。γ線源は１５０ｋＣｉコバルト６０を用いてデュワー瓶中に試料とドライアイスを入れ照射を実施した。なお、各照射位置及びデュワー瓶中の吸収線量は、Ｆｒｉｃｋｅの鉄線量計で測定した。

　室温照射は、０〜１６ｋＧｙ（一部１２ｋＧｙ）まで２ｋＧｙ間隔、８段階（一部６段階）で実施した。ドライアイス凍結では、０〜３６ｋＧｙまで３ｋＧｙ間隔、１２段階で実施した。

３ ウイルス力価の測定

　γ線照射後のウイルス力価を測定し、ウイルス不活化の効果を調べた。ウイルスの測定は、９６穴マイクロプレートに培養した各種細胞（表−１）を用い細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、Ｂｅｈｒｅｎｓ−Ｋａｅｒｂｅｒ法によりＴＣＩＤ５０を算出した。照射後のウイルス液は原液より１０倍段階希釈し、それぞれ０．０５ｍｌ／穴接種後、維持培養液０．１ｍｌ／穴を分注し、３７℃５％ＣＯ２下で培養してＣＰＥを観察した。

４ 牛血清蛋白へのγ線照射による影響

　血清中の中和抗体価への影響については、ＩＢＲ（牛伝染性鼻気管炎）中和抗体価の異なる２種（４倍と３２倍）の牛血清を用いてウイルス不活化と同じ方法でγ線を照射した。

　牛血清の電気泳動による分画は、中和抗体価測定に用いたものと同一の牛血清を供試した。牛血清の電気泳動による分画の測定は、セルロース・アセテート（ＣＡ）膜を用いて、０．８μｌ／０．８ｃｍで塗布し０．８ｍＡ／ｃｍで４５分間通電した。

　電気泳動像は、ポンソー３Ｒで染色後デカリンで処理し、コンピューティングデンシトメーターで測定した。

○ 実験結果

１ ウイルスの不活化

　室温でのγ線照射によるウイルス不活化試験では、ＲＳ，ＶＳ，ＢＶＤ，ＭＤ及びＢＴウイルスの不活化は図−１に示すようになった。Ｄ１０値はそれぞれ３．４，２．２，１．５及び２．５ｋＧｙで、ＲＳウイルスのＤ１０値が一番高く、ＢＶＤ・ＭＤウイルスのＤ１０値が一番低い値となった（表−２）。

　ドライアイス凍結下でのγ線照射によるウイルス不活化試験では、ＲＳ，ＶＳ，ＢＶＤ・ＭＤ及びＢＴウイルスの不活化は、図−２に示すような結果が得られた。Ｄ１０値はそれぞれ４．４，３．４，２．６及び５．０ｋＧｙで、ＢＴウイルスのＤ１０値が一番高く、ＢＶＤ・ＭＤウイルスのＤ１０値が一番低い値となった（表−２）。

　室温及びドライアイス凍結下のＤ１０値は、ＢＶＤ・ＭＤウイルスが共に一番低い値となった。

２ 血清蛋白への影響

　血清中の抗体価の影響について、２種の異なるＩＢＲ中和抗体価の牛血清を用いて照射を実施したところ、室温では１６．０ｋＧｙ照射で中和抗体価が１〜２管低下した（図−３）。一方、ドライアイス凍結で３６．０ｋＧｙ照射でも中和抗体価は変動しなかった（図−４）。

　ＣＡ膜を用いた血清蛋白の電気泳動像は、中和抗体価が４倍と３２倍の２種の血清において、ドライアイス凍結及び室温下の照射とも同様のパターンを示した。室温下では、６．０〜８．０ｋＧｙでβグロブリン分画とα及びγ分画の接点は平となり、８．０〜１０．０ｋＧｙ以上では、α、β、γグロブリン分画が１峰を形成してグロブリンの変性が認められた（図−５）。しかし、ドライアイス凍結下では、３６．０ｋＧｙでもアルブミン分画及びα、β、γグロブリン分画の４峰を示した（図−６）。

○ 考察

　輸入畜産物のうち肉類及び臓器類は、食用に供されることから、消毒が実施できず、輸入可能な仕出し地域が制限されている。また、動物の血液も用途により検疫対応の困難なものがあり、新しい消毒方法の開発が望まれている。

　今回、ＲＮＡウイルスを用いて、γ線によるウイルス不活化を検討し、併せて血清蛋白の変性についても若干の検討を加えた。

　Ｔｏｍａｓらによると、γ線による室温照射でＲＮＡウイルスのＢＴ，ＢＶＤ・ＭＤ及びＤＮＡウイルスのＩＢＲの各ウイルスのＤ１０値は、すべて２ｋＧｙ以下と報告〔２〕されている。著者らはＩＢＲウイルスの室温におけるＤ１０値は、１．１〜１．２ｋＧｙと報告〔３〕した。また、今回実施したＢＶＤ・ＭＤウイルスの室温におけるＤ１０値は、１．５ｋＧｙでＴｏｍａｓらの報告と一致したものの、ＢＴウイルスのＤ１０値は、２．５ｋＧｙとやや高い値になった。

　一方、ドライアイス凍結下でＢＴウイルスを供試したγ線照射による不活化試験において、Ｃａｍｐｂｅｌｌは、マウス脳継代ＢＴウイルスと細胞培養ＢＴウイルスのＤ１０値がそれぞれ６．１〜６．５と５．６〜６．３ｋＧｙと報告〔４〕している。今回実施したドライアイス凍結下のＢＴウイルスのＤ１０値が５．０ｋＧｙとなり、Ｃａｍｐｂｅｌｌの結果よりやや低い値となった。

　これらの成績から、ウイルス粒子の大きさ、核酸の種類、エンベローブの有無など性質の異なる４種類のウイルスを用いて室温及びドライアイス凍結下でγ線照射を実施した結果は、室温及びドライアイス凍結下でのＤ１０値がそれぞれ１．５〜３．４ｋＧｙ及び２．６〜５．０ｋＧｙ（表−２）で、γ線の直接作用しか働かないと考えられるドライアイス凍結下の方が高い値となった。

　このことは、γ線による殺菌効果が、水分が多量に存在する系では、おもに水に直接作用することによって生成する水分解ラジカルが生体内ＤＮＡ鎖切断を引き起こし、この間接作用によって殺菌作用が生じる。しかし、水分がほとんどない乾燥状態やラジカル移動が妨げられる凍結状態では、間接作用の割合が少なくなり、γ線の直接作用の割合が大きくなるという理論〔１〕を裏付ける結果となった。

　Ｔｏｍａｓらは、ウイルスのビリオンコアのサイズとＤ１０値との間に完全な負の相関はなかったと報告〔２〕している。これまでに実施した成績と今回の成績から各種のウイルスの性状〔５〕〔６〕とＤ１０値を比較（表−３）したところ、ビリオン直径が比較的小さいＢＶＤ・ＭＤウイルスのドライアイス凍結及び室温下でのＤ１０値は、これよりビリオン直径の大きいＶＳやＲＳウイルス等に比較し低い値となった。このことからウイルス直径とＤ１０値の間に必ずしも負の相関は認められず、ＴｏｍａｓらのビリオンのコアサイズＤ１０値の成績とほぼ一致した。

　また、ウイルスの分子量、核酸の相違、エンベローブの有無によるＤ１０値との関係は、今回の成績では明らかにならなかった。今後、試験の例数を増やすとともにウイルスの種類も増やして検討していく必要があると思われる。

　血清中の抗体価の変化は、室温下の照射で中和抗体価が１〜２管低下したもののドライアイス凍結下では抗体価の変動は認められなかった。同様に、電気泳動像でも室温下では、グロブリン分画に変化を認めたが、ドライアイス凍結下では著明な変化を認めなかった。

　このように、ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスは、共にドライアイス凍結下で３０ｋＧｙの線量を照射することにより１０゜ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス量を不活化出来ることが明らかとなった。また、血清中のウイルス不活化には、線量は多く必要とするもののドライアイス凍結下で実施すれば、血清成分の変性が少なく、かつ抗体価に影響しないでウイルスを不活化することが可能な知見を得た。

　このことから、動物の血清や血液製剤に対する消毒方法としてγ線照射に有用性が示唆された。なお、今後ドライアイス凍結下でのγ照射による蛋白質への影響については、より詳細なデータを取り、分析する必要があると考える。

○ 文献

〔１〕伊藤　均：ニューフードインダストリー，１２，１７−２２

　　　（１９８６）

〔２〕Ｔｏｍａｓ　Ｆ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ：Ｇａｍｍａ　ｒａｙ

　　　ｉｎａｃｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ａｎｉｍａｌ

　　　ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．，４５，

　　　３９７−３９９（１９８１）

〔３〕野々宮孝、伊藤　均ら

　　　：γ線照射による牛伝染性鼻気管炎ウイルス不活化、食品照射、

　　　２５，８３−８８（１９９０）

〔４〕Ｃａｍｐｂｅｌｌ　Ｃ．Ｈ．

　　　：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｂｌｕｅ−ｔｏｎｇｕｅ

　　　ｖｉｒｕｓ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｇａｍｍａ

　　　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ，３，４０１−４０６

　　　（１９８５）

〔５〕保坂康弘ら：ウイルス図鑑、講談社、６６−６７（１９７２）

〔６〕Ｍｏｈａｎｔｙ．Ｂ　ａｎｄ　Ｄｕｔｔａ．Ｋ

　　　：Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（獣医ウイルス学、

　　　訳：小西信一郎ら）文永堂、１１８−１２１（１９８２）

（１９９２年５月２９日受理）