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検知法（ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ　ＭＥＴＨＯＤ）：食品が適切に照射されたものか知るための検定方法

検知法

発表場所 : 食品照射研究運営会議（放射線照射による馬鈴薯の発芽防止に関する研究成果報告書［資料編］）
著者所属機関名 : 厚生省国立予防衛生研究所
発行年月日 : 昭和４６年　６月３０日

馬鈴薯の検知に関する研究

馬鈴薯の検知に関する研究

○ 序

　放射線、とくにＸ線照射によって、馬鈴薯の発芽を抑制し、貯蔵期間の延長をはかる試みは、すでに各国において実用化の段階に入っている。発芽抑制の目的に適った実用線量（７〜１５ｋｒａｄ）では、栄養価その他風味などに影響がみられず、また食品工業原料としての品質などにも、何等悪影響が認められていない。さらに、重要な問題としての長期動物飼育による安全性の確認試験においても、有害作用があるという報告は見当たらない。

　しかし、一方、各国においても、いまだに照射食品であることを識別する方法は見出されていない。また、現状では、既に安全性が確認されている線量、すなわち、適正線量で照射が施されているか否かを識別する方法としては、照射時にラドカラーを貼付する方法以外には、

　馬鈴薯は、生鮮農作物であり、その品種、作付環境、収穫時期、貯蔵期間あるいは条件が不明の場合は、試料採取の方法や対照物の採り方による変動の方が、はるかに大きい場合も考えられるので、物質レベルを問題とするならば、ある成分の消長あるいは、ある成分の新しい生成がみられた時に、はじめて照射の有無を確認することができるのではないかと考えられる。

　以下、われわれが行ってきた照射処理の検知法に関する基礎的研究とその結果について報告する。

1 試料および貯蔵条件

（１） 島原（試料番号１）

　収穫時期：昭和４４年６月２６〜２８日

　産　　地：長崎県

　照射時期：昭和４４年７月８日

　貯蔵条件：温度；２０〜２２℃

　　　　　　湿度；５０〜８０％

　　　　　　期間；昭和４４年７月１０日〜昭和４４年１２月１２日

（２） 農林１号（試料番号２）

　収穫時期：昭和４４年９月１５〜２０日

　産　　地：北海道

　照射時期：昭和４４年１０月２８日

　貯蔵条件：温度；２０〜２２℃

　　　　　　湿度；５０〜８０％

　　　　　　期間；昭和４４年１１月４日〜昭和４５年３月２１日

（３） 農林１号（試料番号３）

　収穫時期：昭和４３年９月２５日

　産　　地：北海道

　照射時期：昭和４３年１１月１３〜１４日

　貯蔵条件：温度；（室温）

　　　　　　湿度；成りゆき

　　　　　　期間；昭和４３年１１月２５日〜昭和４５年５月１０日

（４） 男しゃく（試料番号４）

　収穫時期：昭和４３年９月２５日

　産　　地：北海道

　照射時期：昭和４３年１１月１３〜１４日

　貯蔵条件：温度；室温

　　　　　　湿度；成りゆき

　　　　　　期間；昭和４３年１１月２５日〜昭和４５年５月１０日

（５） 照射線源及び線量

　日本原子力研究所

　　高崎研究所　　　　　γ線（Ｃｏ−６０）

　何れも７、１５および３０ｋｒａｄの照射

２ 実験方法

（１） 試料の調製

　塊茎の頂部および底部で栄養成分の分布が異なることから縦の輪切り（中心軸にそって）を３個体から平均に採取した。ただし、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅについては横の輪切り（中心軸に直角に）とした。

（２） 酵素活性

（ｉ） Ａｍｙｌａｓｅ

　Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ法＊１）に従い、ｐＨ５．０のＡｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ中で酵素液１ｍｌが３７℃３０分で分解しうる１％可溶性澱粉液量を求めた（Ｄ３７゜３０’で表示）。また、ｍｅｓｔｅｃｋｅｙ＊１０）によるｓｔａｒｃｈ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅを用いて、簡便法についても検討した。

（ｉｉ） Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

　Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法＊２）により、酸性およびアルカリ性下で、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅを基質としたときに生成するｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを４１０ｍμで比色定量した。

（ｉｉｉ） Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ

　Ｒｅｉｔｍａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ法＊３）に基づいて、ａｌａｎｉｎｅまたは、ａｐａｒａｔｉｃ　ａｃｉｄ　と　２−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ　を基質として、生成するＰｙｒｕｖｉｃ　ａｃｉｄまたは、ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　をｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｈｙｄｒａｚｉｎｅにより発色、比色定量した。

（ｉｖ） Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａｓｅ

　Ｈｏｌｄｅｎ＊４）の方法に従い、試料を５０％以上のアセトン濃度で、脱水粉末となし、これをアセトン５０％、クエン酸緩衝液（０．４Ｍ）、Ｃｕ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ（２ｍｇ／ｍｌ）の基質中（ｐＨ８．０）に懸濁し、２５℃で２、５、８、２０時間のインキュベート後、分解生成物のｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅを分別し、比色定量した。

（ｖ） その他

　Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ＊１３）（ＣｒｅｓｏｌａｓｅとＣａｔｅ　ｃｈｏｌａｓｅ）、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ＊１３）などについても検討した。

（３） 糖　　類

（ｉ） 水溶性総糖類

　水溶性総糖量は、除タンパク後、ａｎｔｈｒｏｎｅ法で測定した。

（ｉｉ） 還元糖

　Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎの変法＊５）により定量し、グルコースとして表示した。

（ｉｉｉ） 非還元糖

　（ｉ）から（ｉｉ）を差引き、蔗糖として表示した。

（ｉｖ） デオキシ糖

　Ｗ．Ｗｏｒａｖｄｅｋａｒ＊６）らの方法に従い、過ヨウ素酸酸化により生成した　ｍａｌｏｎ＝ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ　と　ｔｈｉｓｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄとの縮合物を比色定量した。

（４） アスコルビン酸

　Ｒｏｅの２．４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｈｙｄｒａｚｉｎｅ　法にＴＬＣを併用、改良した方法＊７、８）を用いて定量した。なお、従来のＲｏｅの原法では酸化型アスコルビン酸として定量したものが、ＴＬＣでは真のアスコルビン酸としては痕跡程度しか存在しないことが明かとなったので、総アスコルビン酸として定量、表示した。

（５） その他

　アミノ酸のｔｙｒｏｓｉｎｅはＣｅｒｉｏｔｔｉ＊９）らの方法、クロロフィル、リグニン様物質（フロログルシン硫酸法）、ジベレリン酸＊１１）、無機リン＊１２）、アンモニア態窒素、アルデヒド類は常法により検討した。

３ 結果および考察

（１） Ａｍｙｌａｓｅ

　試料３、４の貯蔵後３カ月目の発芽期の結果は、第１表の通りである。非照射、７ｋｒａｄ照射のものは、１５ｋｒａｄ，３０ｋｒａｄ照射したものよりも、やや活性が高いが、貯蔵初期には、試料１、２を用いた場合でも、何れも活性が低く、差異は認められなかった。また、ジベレリン溶液（０．０５Ｍ）に２４時間浸漬しても、試料中の酵素賦活化は認められず、Ａｍｙｌａｓｅの活性を比較することは、有効な手段とは考えられない。

（２） ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

　Ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　の測定結果は、第２表に示した。また、個体間の酵素活性値の「ばらつき」をみるため、男しゃくを選び、５個体の数値を求めたところ、各個体の活性値にみられる標準誤差は約７％であり、５％の危険率をみるとき信頼値は平均±１７．６％の幅となった。従って第２表の結果から、照射の影響を、これによって推測することは困難であると思われる。

（３） Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ

　島原を選び、ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅの代表的な酵素活性としてＧＯＴ．ＧＰＴを測定し、第３表にその結果を示した。照射直後は、照射処理を施したものの方が高い値を示した。しかし、本測定のように、各群から出来るだけ大きさの揃った個体を５個選んで測定しても、各個体間のばらつきは、大体±７％（平均値）であった。したがって、５％の危険率をみるとき、信頼値の幅は±１７％となり、未知の試料の酵素活性が高くとも、これが照射処理を施したものであるか否かを推定することはできない。また、農林１号および男しゃくについても上述同様な傾向を示した。

（４） Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａｓｅ

　酵素活性が最も高い発芽期（貯蔵後３カ月）の結果を第１（ａ）、（ｂ）図に示した。図のようにインキュベートの初期には、照射したものの方が低い傾向を示したが、これは量的に誤差値内に入るものである。

　また、アセトン粉末の代わりにｆｒｅｓｈ　ｔｉｓｓｕｅ（クエン酸ソーダ溶液中でホモジナイズしたもの）を用いた場合も同様であり、ジベレリン溶液（５ｐｐｍ）２４時間浸漬したものでも変化はみられなかった。この酵素は、粗製で、かつ、アセトン溶液中でのみ活性を示すが、その反応は遅く、しかも精製するに従って、活性を失うので、検知法としては適当な方法とは思われない。

（５） Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　およびＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｓｅ　ｃｒｅｓｏｌａｓｅ）

　ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅはＨ２Ｏ２（２×１０・Ｅ（−３）Ｍ）、Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（１０・Ｅ（−６）Ｍ）、Ｃａｔｅｃｈｏｌａｓｅ　はＣａｔｅｃｈｏｌ（５×１０・Ｅ（−８）Ｍ），、ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（２．５×１０・Ｅ（−７）Ｍ）Ｃｒｅｓｏｌａｓｅ　はＰ−ｃｒｅｓｏｌ（１×１０・Ｅ（−４）Ｍ）、Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（１×１０・Ｅ（−４）Ｍ）をそれぞれ基質として、馬鈴薯（男しゃく）の皮部および肉質部に分けてＢｅｎｚｉｄｉｎｅ色素法で測定した。Ｐｅｒｏｘｉｄｅ活性は皮部にみられ照射後１カ月（３０ｋｒａｄ）で非照射のものの約２倍に達し、２および３カ月後でもやや高い傾向を示したが、肉質部では活性は極めて低く、照射、非照射の間で判然とした差異は認められなかった。一方、Ｃａｔｅｃｈｏｌａｓｅおよびｃｒｅｓｏｌａｓｅは何れも皮部、肉部ともに照射、非照射間に有意差は認められなかった。

（６） 糖　　類

　蔗糖（５％、２０％）溶液に、γ線を１．５×１０・Ｅ（４）、８．０×１０・Ｅ（４）、１．６×１０・Ｅ（５）ｒａｄ，２８℃で照射した基礎実験の結果を第２図に示した。

　これは２６５〜２７０ｍμの間のグルコース、フラクトースなどの単糖類と一致するピークが、１．５×１０・Ｅ（４）ｒａｄ（１５ｋｒａｄ）で現れ、このピークは照射線量を増すに従って増大することを示している。また、濃度が稀薄な溶液で、ｒａｄｉｏｌｙｓｉｓが増強されるかどうか確かめるために、５％及び２０％溶液での照射結果を比較したが、この濃度では、２０％溶液のｒａｄｉｏｌｙｓｉｓの方が大きかった。

　これらの結果から、照射により還元糖量が増加するものと推定し、照射後発芽（非照射群）または腐敗（照射群）がはじまるまでの期間の品種別による還元糖および非還元糖量の変化を第３（ａ），（ｂ），（ｃ）図に示した。総糖量（第３（ａ）図）は、照射後、３カ月以内では増加の傾向がみられたが、これは、とくに還元糖の増加によるものとは思われなかった（第３（ｂ）図）。

　貯蔵期間中の糖含量変化は農林１号（２、３）および男しゃく（４）は大体同じような傾向を示し、時期による変動が小さいのに対して、島原（１）では還元糖及び非還元糖ともに農林１号の約２倍量を含有し、時期による変動は著しかった。しかし、貯蔵後２カ月を経ると照射線量間に一定の傾向は認められなくなった。とくに品種や貯蔵期間の不明なものにあっては、糖の含有量の多少から照射の有無を推定することは不可能であると思われる。

　また、ｄｅｏｘｙ　ｓｕｇａｒについては、蔗糖およびグルコースの２０％水溶液に１５、８０、１６０ｋｒａｄ照射したものおよび、照射馬鈴薯（男しゃく農林１号−７、１５、３０ｋｒａｄ照射）そのもの、および、３０ｋｒａｄ照射馬鈴薯（男しゃく）から調製した澱粉中からは、いずれも検出できなかった。

（７） アスコルビン酸

　基礎的な実験として、アスコルビン酸５％メタ燐酸溶液（１．０７γ／ｍｌ）を、あらかじめノーリットで酸化したものを小カップに２ｍｌずつとり、次の条件で、Ｃｏ−６０によって照射した。各線量別による試料は、ＤＮＰＨ法で定量し、かつＴＬＣ上のスポットの位置を確認した。

　照射によるアスコルビン酸の変化は第４図に示した。

　また、ＴＬＣ上にはアスコルビン酸およびｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　と一致するスポット以外のものは検出されなかった。

　なお、実際の条件とは異にして、予め酸化を行ったのは、実験の簡易化のためであり、また、ノーリットによる酸化は完全に酸化されるものではないが、臭素水やその他による酸化方法と比較するとき、この方法が最も安定した結果を得た。

　しかし、第４図にみられるように、非照射のものより５ｋｒａｄ照射したものの方が高い数値を示すのは、ノーリットで酸化されなかったアスコルビン酸が照射により酸化したものと思われる。この図から１０ｋｒａｄでアスコルビン酸に変化があらわれるが、１３０ｋｒａｄの照射でも、約５０％が残存するところから、アスコルビン酸自体は照射によって、それ程不安定のものではないようである。

　次に島原１、農林１号２について、照射後の貯蔵期間にみられるアスコルビン酸の変化を経時的に測定した（第５図）。両品種とも照射後、貯蔵期間の初期には非照射に比べ、アスコルビン酸含量は、低下の傾向を示すが、３カ月以後にはこの傾向はみられなくなった。しかし、７ｋｒａｄ程度の照射では非照射のものと判別することは出来なかった。

　また、男しゃく４でも、照射後１カ月で非照射試料が、１３．７ｍｇ％を示すのに対し、３０ｋｒａｄ試料では６．６ｍｇ％の低い値であった。しかし、３カ月後には、非照射試料は発芽しはじめ、アスコルビン酸量は、１１．２ｍｇ％を示したのに対し、３０ｋｒａｄ試料は１５．０ｍｇ％と変わり、上記２品種と同様な経過を示した。

（８） その他

　男しゃく試料についてアルデヒド類、アンモニア態窒素、無機燐、ｔｙｒｏｓｉｎｅ，ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ　ａｃｉｄを分析した。また、蛍光灯下で２週間放置してｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌの生成を検した。

　アルデヒド類、アンモニア態窒素は照射、非照射の間で全く差異は認められなかった。また、無機燐、ｔｙｒｏｓｉｎｅは線量別間に大きな差異は認められなかった（第５表）。

　Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ　ａｃｉｄについては、何れの試料からも検出できなかった。しかし、ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ　ａｃｉｄの標品とはＴＬＣ上で一致しないが、蛍光を有するスポットを検出した。このスポットは３０ｋｒａｄ照射のものの方が非照射のものに比べて蛍光が強かったが、蛍光吸収曲線のパターンには、差異が認められなかった。

　次に、馬鈴薯を通常の蛍光灯下に曝すとき、ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　を生成する。この緑皮現象（Ｇｒｅｅｎｉｎｇ）は、γ線照射により抑制されるという報告があるが、照射後１ヶ月の試料では非照射および７ｋｒａｄ照射試料を１００とするとき、１５および３０ｋｒａｄの試料は５５．３であった。しかし、貯蔵日数の経過とともに緑皮現象は不活発となる。また、ジベルリン処理、炭酸ナトリウム処理を施しても緑皮現象は促進されなかった。

４ 結　　語

　これまでの照射馬鈴薯における研究結果から、γ線処理により明らかに変化するような酵素活性を測定する方法は、各個体別によりバラツキが大きいという点からも、照射、非照射の検知法としては適性を欠くように思われる。

　一方、栄養成分の変化については、照射後、貯蔵期間が３ヶ月までは、非照射のものとある程度の数値的な差異は認められるが、これらは新しい成分の生成や、ある成分の消失といったものではなく、量的な増減にすぎないため、この数値が非照射と照射処理したものとの間で極端な差異がなければ検知法としての用をなさない。また、貯蔵期間が３ヶ月を過ぎると、その差異は認められなくなるので、この種の物質レベルでの検知法としては、現段階では不適当である。したがって、これからの問題として、γ線照射による発芽抑制が他発的休眠を与えるｍａｌｅｉｃ　ｈｙｄｒａｚｉｄｅ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅなどの化学薬剤による発芽抑制と共通した機構によるものか否か、また、差異があるものであるならば、いかなる点にあるのかを解明することが必要である。

　また、γ線照射による発芽抑制機作が、休眠機構の延長ではなく、単に発芽細胞の破壊によるものと推定するならば組織学的に比較する検知法がより効果的であると考えられる。たとえば、形態学的検索は勿論であるが、組織切片上での化学的あるいは酵素学的反応を利用することによって、本報の結果をさらに詳細に解明しうるものと思われる。しかし上述した通り、組織学的検知法もまた、化学薬剤処理を施したものと比較検討することが必要となるものと考えられる。

○ 文　　献

　１）　Ｊ．Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．９，１（１９０８

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　２）　Ｏ．Ａ．Ｂｅｓｓｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，

　　　　１６４，３２１（１９４６）

　３）　Ｓ．Ｒｅｉｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ

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　４）　Ｍ．Ｈｏｌｄｅｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７８，３５９（１９６１

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　５）　Ｍ．Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５，１９（１

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　６）　Ｗ，Ｓ．Ｗａｒａｖｄｅｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ

　　　　ｅｍ．，２３４，１９４５（１９５９）

　７）　Ｈ．Ｈａｓｓｅｌｑｉｓｔ　ｅｔ　ａｔ．，Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ．Ｓ

　　　　ｃａｎｄ．１７，５２９（１９６３）

　８）　Ｓｔｒｏｈｅｃｋｅｒ．，Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ．Ｆｏｒｓ

　　　　ｃｈ．，１１８，３９４（１９６３）

　９）　Ｇ．Ｃｅｒｉｏｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ．，６６，６０７

　　　　（１９５７）

１０）　Ｊ．Ｍｅｓｔｅｃｋｙ．　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｌ．，３０，１９０（１

　　　　９６９）

１１）　Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅ

　　　　ｍ．，１６，５２０（１９６８）

１２）　中村道徳、農化、２４、１（１９５０）

１３）　Ｒ．Ｐ．Ｆ．Ｇｒｅｇｏｒｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．，１０１，５

　　　　８２（１９６６）

　　　　（宮木高明、俣野景典、土田雅子、衛藤朝子、中村知子）